在歐盟，飲用水的微生物質(zhì)量受到嚴格監(jiān)管，要求每100毫升水中腸道腸球菌和大腸桿菌的菌落形成單位不超過零個。傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的參考方法或最可能數(shù)（MPN）方法需要1-2天才能得出結(jié)果，這可能導致在污染事件發(fā)生時延誤及時采取行動。相比之下，分子技術可以在幾小時內(nèi)提供結(jié)果。因此，開發(fā)和驗證一種與參考方法一樣可靠的替代方法對于滿足歐盟飲用水指令（DWD）2020/2184的要求至關重要。
本研究的替代方法基于實時RT-PCR技術，靶向大腸桿菌的16S rRNA基因。該方法由荷蘭和弗拉芒飲用水實驗室開發(fā)并驗證，JRC對其進行了微調(diào)，使其在RNA提取過程中更具靈活性。研究分為兩個階段：第一階段的實驗室間研究于2021年10月啟動，涉及16個組織的18個實驗室；第二階段的研究于2023年3月進行，涉及17個組織的19個實驗室。
圖1（不同污染水平下Ct值的分布）：展示了各參與實驗室對不同污染水平的水樣檢測結(jié)果，表明Ct值隨著污染水平的增加而逐漸降低，且大多數(shù)實驗室能夠有效區(qū)分陰性和陽性樣本。
在第二階段的研究中，JRC負責所有樣品的過濾工作，使用混合纖維素濾膜用于參考方法，而使用聚碳酸酯濾膜用于替代方法。樣品被分發(fā)給參與實驗室，進行RT-PCR分析。研究的主要目標包括：驗證分子方法在歐盟代表性規(guī)模上的適用性；測試改進后的分子方法作為常規(guī)大腸桿菌檢測的替代方法；識別替代方法的關鍵組成部分以滿足與標準方法的等效性標準；并提出進一步改進的建議。
圖2（各參與實驗室的Z分數(shù)表現(xiàn)）：通過Z分數(shù)評估各實驗室在不同污染水平下的檢測結(jié)果，顯示大多數(shù)參與實驗室的平均Z分數(shù)在“很好”或“優(yōu)秀”范圍內(nèi)，證明了替代方法的可靠性。
經(jīng)過兩輪實驗室間研究，替代方法顯示出略低于參考方法的敏感性（91.1% vs. 97.2%），但能夠更快地提供結(jié)果，使其成為一種有價值的篩查工具。在第二階段的研究中，替代方法的特異性為97.7%，敏感性為91.1%，相對檢測水平（RLOD）為1.790，表明參考方法的敏感性高于替代方法，但替代方法仍滿足方法比較研究的可接受性標準。
這項研究首次在歐盟范圍內(nèi)驗證了實時RT-PCR技術作為飲用水中大腸桿菌檢測的替代方法的可行性。該方法能夠在4-6小時內(nèi)完成檢測，相較于傳統(tǒng)的21-24小時，大大縮短了檢測時間。這對于及時發(fā)現(xiàn)飲用水中的糞便污染、預防水傳播疾病和保護公共健康具有重要意義。
參考文獻：Gomez L, Brand?o J, Navarro A, et al. Application of a real-time reverse transcription polymerase chain reaction for rapid detection of Escherichia coli in drinking water: an EU representative study[J]. Environmental research, 2025: 121786.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~徐禮龍。
