微生物斜面菌種接種與培養(yǎng)操作指南！
發(fā)布時(shí)間：2025-05-13 瀏覽次數(shù)：362
一、操作流程
1. 準(zhǔn)備工作
標(biāo)記試管
用油性記號(hào)筆在斜面試管外壁標(biāo)注：菌種名稱、接種日期、操作者姓名（避免使用易脫落的標(biāo)簽）。
若使用預(yù)滅菌試管，檢查封口是否完好，避免污染。
無(wú)菌環(huán)境準(zhǔn)備
用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面、雙手及工具表面。
點(diǎn)燃酒精燈，操作區(qū)域限制在火焰周圍10-15cm范圍內(nèi)（無(wú)菌區(qū)）。
準(zhǔn)備菌種管和空白斜面試管，左手持兩管，斜面朝上呈30°角（菌種管在前，便于快速操作）。
2. 工具滅菌與試管處理
接種工具滅菌
右手持接種環(huán)（針），將金屬部分垂直置于酒精燈外焰燒至紅熱（持續(xù)3-5秒），冷卻后使用。
注意：若使用帶塑料柄的接種環(huán)，避免火焰直接接觸塑料部分。
松動(dòng)棉塞：在火焰旁輕輕旋轉(zhuǎn)兩試管的棉塞，使其易于快速拔出。
3. 取菌與接種操作
試管口滅菌：左手持兩試管，右手小指與無(wú)名指夾住棉塞拔出，試管口短暫過(guò)火焰（2-3秒）滅菌。
取菌技巧
冷卻后的接種環(huán)輕觸菌種管空白培養(yǎng)基區(qū)域（如無(wú)冷凝水，可輕觸內(nèi)壁降溫）。
挑取單菌落邊緣菌苔（避免挑取過(guò)厚或老化的菌體），動(dòng)作輕快，防止高溫?fù)p傷菌種。
劃線接種
接種環(huán)與斜面角度：40°-45°
劃線力度：輕觸表面，避免劃破瓊脂（劃痕可能導(dǎo)致雜菌滋生）。
劃線密度：若需單菌落，采用四區(qū)劃線法（每區(qū)后灼燒接種環(huán)）。
將菌種轉(zhuǎn)移至空白斜面，從底部向管口方向劃“Z”形線（如圖示）。
關(guān)鍵參數(shù)：
4. 封管與工具處理
封管滅菌
接種后試管口再次過(guò)火焰，迅速塞緊棉塞（避免火焰燒焦棉塞）。
若使用硅膠塞或螺旋蓋，需在火焰旁旋緊。
工具二次滅菌：接種環(huán)先在火焰上灼燒至殘留菌體碳化（防止飛濺），再?gòu)氐谉t滅菌。
5. 培養(yǎng)條件
溫度與時(shí)間
| 微生物類型 | 培養(yǎng)溫度 | 培養(yǎng)時(shí)間 |
|---|---|---|
普通細(xì)菌 | 37℃ | 18-24小時(shí) |
真菌（如霉菌） | 25-30℃ | 3-5天 |
嗜熱菌 | 55-60℃ | 24-48小時(shí) |
其他參數(shù)
濕度：保持培養(yǎng)箱濕度60-70%（防止培養(yǎng)基脫水）。
避光：對(duì)光敏感的菌種需用錫箔紙包裹試管。
二、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與問(wèn)題解決
1. 無(wú)菌操作核心原則
三不原則：
棉塞不碰桌面（始終夾在手指間）。
試管口不對(duì)空氣開放（火焰旁操作）。
滅菌工具不接觸未滅菌表面。
污染應(yīng)急處理：若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁或異味，立即高壓滅菌（121℃, 20分鐘）后丟棄。
2. 常見問(wèn)題與優(yōu)化
| 問(wèn)題現(xiàn)象 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
斜面無(wú)生長(zhǎng) | 接種環(huán)溫度過(guò)高燙死菌種 | 冷卻時(shí)間延長(zhǎng)至5-8秒 |
雜菌污染 | 試管口未充分滅菌 | 試管口過(guò)火時(shí)間延長(zhǎng)至5秒 |
劃線不均勻 | 接種環(huán)角度或力度不穩(wěn)定 | 練習(xí)模擬劃線（未接種時(shí)訓(xùn)練手感） |
培養(yǎng)基開裂 | 瓊脂濃度過(guò)低或脫水 | 調(diào)整瓊脂濃度至1.5-2.0% |
3. 特殊菌種操作
厭氧菌：使用厭氧罐或抽換氣系統(tǒng)，培養(yǎng)基中添加還原劑（如半胱氨酸）。
病原菌：在生物安全柜中操作，穿戴防護(hù)服及手套，廢棄物需高壓滅菌。
三、操作后管理
菌種保存：
短期保存：4℃冷藏，普通細(xì)菌可存活1-3個(gè)月。
長(zhǎng)期保存：甘油凍存管（-80℃）或真空冷凍干燥。
記錄與標(biāo)記：詳細(xì)記錄菌種傳代次數(shù)、培養(yǎng)基批次及培養(yǎng)結(jié)果。
通過(guò)嚴(yán)格執(zhí)行上述步驟，可顯著提高斜面接種成功率，減少污染風(fēng)險(xiǎn)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠菌種來(lái)源。
