無菌技術“規(guī)范”操作指南
發(fā)布時間：2025-05-26 瀏覽次數(shù)：221
為了保證實驗能夠在無菌環(huán)境下順利進行，僅僅依靠培養(yǎng)液、器械和試驗環(huán)境等徹底消殺是遠遠不夠的，這些都是前提條件。操作人員身上或多或少都會攜帶各種微生物，有可能再次污染環(huán)境，再加上空氣的流通性，也增加了再次污染實驗室的可能性。
因此，為了試驗的順利開展，最大限度地避免雜菌污染，需要我們熟練并規(guī)范地進行無菌操作，無菌操作是試驗成功的關鍵，必須嚴格遵守操作規(guī)程，以確保實驗的順利進行。
一、無菌技術概念
在微生物學實驗操作過程中，在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施。
無菌操作技術主要包括兩個方面：創(chuàng)造無菌操作環(huán)境和在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其他微生物的侵入的措施，也就是無菌操作技術。
二、無菌操作原則
1. 區(qū)分無菌區(qū)和非無菌區(qū)，操作前戴好口罩、手套和工作服；
2. 放入超凈工作臺里的物品，必須經(jīng)過滅菌，不能擺放太擠；
3. 使用完，一定要將無關物品全部取出來，紫外照射后關閉；
4. 操作要在酒精燈旁邊操作；
5. 保證接種針冷卻后再轉移目標菌；
6. 灼燒接種針上多余的菌種，以免污染環(huán)境。
三、無菌操作環(huán)境
指的是在使用前，無菌室或潔凈間需要消殺處理，創(chuàng)造無菌的操作環(huán)境。
1. 無菌室消毒
一般情況，在使用前，打掃衛(wèi)生，用84消毒液或新潔爾滅擦拭臺面和地面，打開紫外燈照射30min以上，使用時，關閉紫外燈，通風10min再進入操作。
每月用甲醛熏蒸一次，至少通風兩天再進入使用。
根據(jù)需要可以適當增加消毒次數(shù)。
對于不需要潔凈間，或沒有潔凈間的實驗室，也要定期進行消殺。
對于大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)常污染噬菌體，需要經(jīng)常用臭氧消殺實驗室。
無關物品不允許放入無菌室。
2. 超凈工作臺消毒
（1）使用前，用75%酒精擦拭操作臺面和四周，放入待使用物品（已經(jīng)全部滅菌），打開紫外燈照射30min。
（2）使用時，打開風機5min后，進入超凈工作臺操作。
（3）使用后，將無關物品全部取出，擦拭臺面，打開紫外燈照射5min，關機。
四、無菌操作技術
1. 接種針灼燒滅菌：
進入超凈工作臺前，用75%酒精擦拭雙手，進入超凈工作臺內，待酒精揮發(fā)完全，點燃酒精燈，將接種環(huán)及金屬棒在火焰上灼燒，將接種環(huán)燒至發(fā)紅，來回灼燒金屬棒，尤其是接口處。
2. 接種針冷卻：
接種針滅菌后，移到酒精燈旁邊冷卻，備用。
3. 接種針接種：
配制好固體或液體培養(yǎng)基后，利用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌，經(jīng)過滅菌后培養(yǎng)基里無任何微生物，在超過經(jīng)工作臺內，用接種針等將目標菌種接種到培養(yǎng)基中的過程叫無菌操作。
簡單來說，在無菌條件下，將目標菌種轉接到無菌培養(yǎng)基上的過程叫無菌操作。
（1）平板劃線：利用接種環(huán)將目標菌種在固體培養(yǎng)基表面劃線，菌種逐步稀釋，培養(yǎng)后能夠長出許多單一菌落，從而達到菌種分離純化的目的。
①取菌種：取出目標菌種，融化后，備用；
②接種針滅菌：灼燒接種針進行滅菌；
③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；
④蘸取菌種： 甘油管用75%酒精消毒，待酒精揮發(fā)完全，在酒精燈火焰略微滅菌（防止烤糊），然后用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌種；
⑤劃線：取已經(jīng)備好的固體平板，邊轉動平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），用上述接種環(huán)在平板上劃線，先在一側連續(xù)劃線3-4次，邊轉動平板邊用酒精燈灼燒接種環(huán)，冷卻后，用接種環(huán)穿過第一次劃線部分繼續(xù)劃線3-4次，同樣方法進行第三次劃線，或第四次劃線（根據(jù)菌液濃度和菌種類型確定劃線次數(shù)），灼燒接種環(huán)；
⑥標記：在平板底部邊緣處標記菌種名稱，日期和其他信息；
⑦培養(yǎng)：放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
⑧保存：待培養(yǎng)完成后保存于4℃冰箱，待用。
（2）斜面接種：從生長好的平板菌種轉接到新鮮斜面培養(yǎng)基上的接種。
①取菌種：取出目標菌種平板；
②接種針滅菌：灼燒接種針進行滅菌；
③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；
④挑取菌種：在火焰旁打開平板塞子，邊轉動平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），立即將接種環(huán)伸入平板上，挑取單菌落后蓋上平板蓋子，然后左手迅速取出新鮮試管，在火焰旁右手小指取下塞子，并灼燒試管管口，將黏有單菌落的接種環(huán)迅速放進新鮮斜面的底部，從下至上Z字劃線，蓋上試管塞，灼燒接種環(huán)；
⑤標記：在平板底部邊緣處標記菌種名稱，日期和其他信息；
⑥培養(yǎng)：放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
⑦保存：待培養(yǎng)完成后保存于4℃冰箱，待用。
（3）液體接種：操作同上。
五、注意事項
1. 所有試驗都必須在無菌條件下進行，在打掃衛(wèi)生、實驗室消毒過程中，一定要做好個人防護。
2. 試驗過程中，一定要正確使用酒精燈，避免著火。
3. 區(qū)分滅菌物品和未滅菌物品，以免混亂，影響試驗結果。
4. 試驗結束一定要將無關物品從超凈工作臺中取出，該滅菌的物品一定要滅菌后再處理，避免交叉污染。
5. 采用菌落沉降法定期檢查實驗室情況。
6. 試驗過程中，盡量減少人員流動。
7. 試驗過程中，避免手部接觸試管口、三角瓶等，以免造成污染。
8. 試驗過程中，如果出現(xiàn)意外，比如說著火，別著急，拿上濕抹布覆蓋即可。
來源：環(huán)凱轉載于“微生物知識庫”公眾號；作者~發(fā)酵菌人
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